| 服务编号 | 服务内容 | 服务价格 | 服务周期 |
| AF1004-1 | 组织切片（单标双色） | 45元/张 | 2天 |
| AF1004-2 | 组织切片（双标三色） | 65元/张 | 3天 |
| AF1004-3 | 组织切片（三标四色） | 200元/张 | 4天 |
| AF1004-4 | 组织切片（四标五色） | 300元/张 | 5天 |
| AF1004-5 | 组织切片（五标六色） | 800元/张 | 6天 |
| AF1004-6 | 组织切片（六标七色） | 4000元/张 | 7天 |
| AF1004-7 | 组织芯片（单标双色） | 300元/张 | 3天 |
| AF1004-8 | 组织芯片（双标三色） | 500元/张 | 3天 |
| AF1004-9 | 组织芯片（三标四色） | 1500元/张 | 4天 |
| AF1004-10 | 组织芯片（四标五色） | 2500元/张 | 5天 |
| AF1004-11 | 组织芯片（五标六色） | 4000元/张 | 6天 |
| AF1004-12 | 组织芯片（六标七色） | 8000元/张 | 7天 |
| AF1004-13 | 组织切片荧光扫描（单标双色） | 80元/张 | 3天 |
| AF1004-14 | 组织切片荧光扫描（双标三色） | 100元/张 | 3天 |
| AF1004-15 | 组织切片荧光扫描（三标四色） | 150元/张 | 5天 |
| AF1004-16 | 组织切片荧光扫描（四标五色） | 300元/张 | 5天 |
| AF1004-17 | 组织切片荧光扫描（五标六色） | 500元/张 | 5天 |
| AF1004-18 | 组织切片荧光扫描（六标七色） | 1000元/张 | 5天 |
| AF1004-19 | 组织芯片荧光扫描（单标双色） | 1000元/张 | 3天 |
| AF1004-20 | 组织芯片荧光扫描（双标三色） | 1500元/张 | 3天 |
| AF1004-21 | 组织芯片荧光扫描（三标四色） | 2500元/张 | 5天 |
| AF1004-22 | 组织芯片荧光扫描（四标五色） | 3500元/张 | 5天 |
| AF1004-23 | 组织芯片荧光扫描（五标六色） | 5000元/张 | 5天 |
| AF1004-24 | 组织芯片荧光扫描（六标七色） | 8000元/张 | 5天 |
酪酰胺信号放大(TSA，Tyramide signal amplification)技术是一类利用辣根过氧化酶（HRP）对靶蛋白进行标记的酶学检测方法，类似常规免疫组化的DAB显色方法，TSA技术同样采用HRP标记的二抗，同样有对应的“显色”步骤（HRP催化加入反应体系的酪胺荧光素底物，产生活化荧光底物，活化底物可与抗原上的酪氨酸等残基共价结合，使样品上稳定的共价结合酪胺荧光素。之后用热修复法洗去非共价结合的一抗-二抗-HRP复合物，重复下一种一抗-HRP二抗来第二轮孵育，换另一种酪胺荧光素底物，如此往复就可实现多重标记。
湖南艾方生物科技有限公司
TSA多重免疫荧光实验标准操作流程（石蜡切片、冰冻切片、细胞爬片）
6.1石蜡组织
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序号 |
工作内容 |
工作标准 |
备注 |
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工作步骤一：脱蜡 |
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1 |
实验前检查各染缸内的染料及试剂，开启通风橱内的风机开关 |
保证各染缸液面能没过切片上的组织 |
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2 |
65℃烤片2h； |
把切片从切片盒里小心的拿出，正面朝上，放入温度已达到65℃的烤片机里烤片2 h；如果组织切片在切片时已经进行如上烤片，则只需烤片10 min左右至石蜡完全溶解。 |
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3 |
把待处理的石蜡切片依次装入染色架上； |
烤片完成后把石蜡切片迅速的从烤片机拿出，依次插入染色架里的卡槽里。 |
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4 |
二甲苯（Ⅰ）中脱蜡10 min； |
从烤片机里拿出来到放入装有二甲苯的染色缸的过程中要迅速，因为在保持一定温度下脱蜡，石蜡更容易被二甲苯溶解。 |
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5 |
二甲苯（Ⅱ）中脱蜡10 min； |
此步主要是进一步脱蜡，使组织中的石蜡完全溶于二甲苯中。 |
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6 |
100%乙醇（Ⅰ）中5 min； |
把芯片从二甲苯染色缸中拿出稍晾干，轻轻放入100%乙醇中，二甲苯跟酒精互溶，洗去二甲苯。 |
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7 |
100%乙醇（Ⅱ）中5 min； |
进一步洗去二甲苯,确保二甲苯清洗干净。
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工作步骤二：水化 |
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1 |
95%乙醇中水化5 min |
严格按实验流程操作，目的是使组织细胞充水，恢复脱水前状态。 |
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2 |
85%乙醇中水化5 min |
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3 |
75%乙醇中水化5 min |
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4 |
PBS浸洗3次各5 min |
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5 |
PBST浸洗 30 S |
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工作步骤三：抗原修复 |
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1 |
组织切片置于盛满PH 9.0 EDTA碱性抗原修复液或者PH6.0柠檬酸修复缓冲液的修复盒中于微波炉内进行抗原修复（也可以用高压1-2min 100度水煮15min 95度水浴20min等其他热修复方法）。中火8min，停火8min，转中低火7min，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。(修复液和修复条件根据组织类型以及抗原类型来确定）。 |
根据抗原的不同选择合适的抗原修复液 |
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2 |
PBST浸洗3次各5 min |
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工作步骤四：封闭 |
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1 |
3%过氧化氢溶液室温封闭15 min |
封闭内源性过氧化氢酶，降低其背景染色。 |
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2 |
PBST浸洗3次各5 min |
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3 |
滴加非免疫正常山羊血清100 μl，室温孵育30 min |
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工作步骤六：孵育抗体 |
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1 |
甩去封闭液，滴加100 μl即用型一抗，4℃孵育过夜 |
一抗最好是特异性强的单克隆抗体。HRP-Polymer免疫组化二抗根据一抗的来源进行选择抗鼠、抗兔或通用型 |
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2 |
PBST浸洗3次各5 min |
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3 |
HRP-Polymer抗鼠/兔免疫组化二抗，室温孵育30 min |
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4 |
PBST浸洗5次各5 min |
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工作步骤八：TSA荧光染料标记显色 |
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1 |
TYR-XXX荧光染料反应 3-10min |
具体时间根据预实验及经验确定！ |
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2 |
PBST浸洗3次各5 min |
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|
工作步骤九：重复步骤三至步骤八 |
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|
1 |
工作步骤八换用另外一种TYR-XXX荧光染料 |
根据标记抗原的数量不断重复步骤三至步骤八直至完成所有标记 |
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2 |
PBST浸洗3次各5 min |
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工作步骤十：DAPI复染细胞核 |
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1 |
玻片置于PBST（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。 |
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2 |
切片稍甩干后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min |
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工作步骤十一：荧光封片 |
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1 |
玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。 |
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2 |
切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。 |
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工作步骤十二：镜检 |
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1 |
切片于荧光显微镜/共聚焦/多通道荧光扫描仪/多光谱成像系统下观察并采集图像。 |
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6.2细胞爬片
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序号 |
工作内容 |
工作标准 |
备注 |
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工作步骤一：爬片准备 |
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1 |
将多聚甲醛固定15min的爬片，PBS浸洗3次各5 min |
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2 |
0.1% TritonX-100 破膜15min，PBST浸洗3次各5 min |
检测核/质表达的蛋白采用此步骤；但检测膜表达的抗体不需要此步骤。 |
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工作步骤二：封闭 |
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1 |
滴加非免疫正常山羊血清100-200 μl，室温孵育30 min |
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工作步骤三：孵育抗体 |
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1 |
甩去封闭液，滴加100-200 μl即用型一抗，4℃孵育过夜 |
一抗最好是特异性强的单克隆抗体。HRP-Polymer免疫组化二抗根据一抗的来源进行选择抗鼠、抗兔或通用型 |
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2 |
PBST浸洗3次各5 min |
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3 |
HRP-Polymer抗鼠/兔免疫组化二抗，室温孵育30 min |
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4 |
PBST浸洗5次各5 min |
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工作步骤四：TSA荧光染料标记显色 |
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1 |
TYR-XXX荧光染料反应 3-10min |
具体时间根据预实验及经验确定！ |
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2 |
PBST浸洗3次各5 min |
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工作步骤五：上一轮抗体洗脱 |
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1 |
滴加适量37℃预热至完全溶解的抗体洗脱液覆盖样本，37℃放置5-20分钟，弃去洗脱液，再次滴加适量抗体洗脱液覆盖样本37℃放置5-20分钟，弃洗脱液。 |
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2 |
PBS浸洗3次各5 min |
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工作步骤六：重复步骤二至步骤五 |
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1 |
工作步骤四换用另外一种TYR-XXX荧光染料 |
根据标记抗原的数量不断重复步骤二至步骤五直至完成所有标记 |
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2 |
PBST浸洗3次各5 min |
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工作步骤七：DAPI复染细胞核 |
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1 |
玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。 |
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2 |
切片稍甩干后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min |
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工作步骤八：荧光封片 |
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1 |
玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。 |
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2 |
切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。 |
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工作步骤九：镜检 |
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1 |
切片于荧光显微镜/共聚焦/多通道荧光扫描仪/多光谱成像系统下观察并采集图像。 |
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6.3冰冻切片
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序号 |
工作内容 |
工作标准 |
备注 |
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工作步骤一：样本准备 |
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1 |
将甲醇固定20min的冰冻切片，在纯水浸泡5 min |
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2 |
0.1% TritonX-100 破膜15min，PBST浸洗3次各5 min |
检测核/质表达的蛋白采用此步骤；但检测膜表达的抗体不需要此步骤。 |
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工作步骤二：封闭 |
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|
1 |
3%过氧化氢溶液室温封闭15 min |
封闭内源性过氧化氢酶，降低其背景染色。 |
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|
2 |
PBST浸洗3次各5 min |
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3 |
滴加非免疫正常山羊血清100 μl，室温孵育30 min |
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工作步骤三：孵育抗体 |
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1 |
甩去封闭液，滴加100 μl即用型一抗，4℃孵育过夜 |
一抗最好是特异性强的单克隆抗体。HRP-Polymer免疫组化二抗根据一抗的来源进行选择抗鼠、抗兔或通用型 |
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2 |
PBST浸洗3次各5 min |
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3 |
HRP-Polymer抗鼠/兔免疫组化二抗，室温孵育30 min |
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4 |
PBST浸洗5次各5 min |
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工作步骤四：TSA荧光染料标记显色 |
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1 |
TYR-XXX荧光染料反应 3-10min |
具体时间根据预实验及经验确定！ |
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2 |
PBS浸洗3次各5 min |
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工作步骤五：上一轮抗体洗脱 |
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1 |
滴加适量37℃预热至完全溶解的抗体洗脱液覆盖样本，37℃放置5-20分钟，弃去洗脱液，再次滴加适量抗体洗脱液覆盖样本37℃放置5-20分钟，弃洗脱液。 |
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2 |
PBS浸洗3次各5 min |
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工作步骤六：重复步骤二至步骤五 |
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1 |
工作步骤四换用另外一种TYR-XXX荧光染料 |
根据标记抗原的数量不断重复步骤二至步骤五直至完成所有标记 |
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|
2 |
PBST浸洗3次各5 min |
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|
工作步骤七：DAPI复染细胞核 |
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1 |
玻片置于PBST（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。 |
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|
2 |
切片稍甩干后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min |
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工作步骤八：荧光封片 |
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1 |
玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。 |
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|
2 |
切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。 |
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|
工作步骤九：镜检 |
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1 |
切片于荧光显微镜/共聚焦/多通道荧光扫描仪/多光谱成像系统下观察并采集图像。 |
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